對T細胞進行基因改造使其表達特定的T細胞受體（T cell receptors, TCRs）或嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptors, CARs）已經成為治療惡性腫瘤的有效方法。然而，T細胞功能可能會由于長期刺激而出現耗竭，具體表現為表觀遺傳改變、細胞增殖能力下降、產生細胞因子水平降低、并且細胞會表達PD-1、LAG-3等抑制性受體。因此，通過基因工程技術提高T細胞在長期刺激和激活下的功能和適應性是提高臨床反應的一個有前途的策略。

        2023年9月4日，來自美國加州大學舊金山分校的Alexander Marson研究團隊在Cell雜志在線發表了題目為Modular pooled discovery of synthetic knockin sequences to program durable cell therapies的文章，在這項研究中，研究人員開發了ModPoKI（Modular pooled knockin）篩選平臺，向T細胞的TRAC（TCR alpha constant）位點敲入特定的文庫序列（轉錄因子或蛋白、表面受體），進而篩選出在體外和體內對長期刺激的適應性及抗腫瘤免疫功能有所提高的基因組工程化的T細胞。他們發現同時敲入BATF和TRAP4能夠顯著提升T細胞面對長期刺激的適應性、對腫瘤細胞的殺傷能力，并利用CHIP-seq和ATAC-seq揭示了TRAP4顯著影響T細胞功能的機制。總之，該研究建立了一套可用于高通量篩選和鑒定提高T細胞功能的敲入序列的方法，為構建基因組工程化細胞免疫療法提供了高效技術手段。

        為了實現大規模的基因片段敲入篩選，作者們開發了ModPoKI平臺，將功能元件（轉錄因子和表面受體）片段，與特異性模塊（TCR或CAR）片段相連，通過CRISPR-Cas9系統以非病毒感染的電轉方式將上述片段整合到人類T細胞的TRAC基因位點中。功能元件由兩條特異性條形碼（Barcode）序列所標記，后續可以根據條形碼特異的擴增子來反映敲入目的片段T細胞的數量。相比于作者之前開發的PoKI（Pooled Knockin），ModPoKI篩選范圍更廣，具有更高的敏感性、特異性和準確性。基于轉錄因子和表面受體的功能，作者挑選了100個轉錄因子和129個表面受體用于篩選。大部分轉錄因子均與T細胞增殖分化、殺傷抗腫瘤能力相關。

        作者將T細胞面對單次刺激、長期刺激和強直激活（Tonic signaling）情況下能力的改變作為敲入片段的篩選標準，發現敲入特定序列片段能夠提升T細胞面對不同刺激情況的適應性。將上述轉錄因子或表面受體引入到NY-ESO-1 TCR-T細胞后，作者首先利用多種方式：僅CD3刺激、CD3/CD28磁珠刺激、過度CD3/CD28刺激或與NY-ESO-1+靶細胞對T細胞進行單次刺激。通過條形碼擴增子測序比較不同敲入片段的表達豐度，來判斷敲入后T細胞的數量（即適應性）。結果表示，敲入堿性亮氨酸拉鏈（Basic leucine zipper）轉錄因子（BATF和BATF3）、螺旋-環-螺旋（Helix-loop-helix）轉錄因子（ID2和ID3）后，T細胞適應性有了顯著提升。另一方面，嵌入多種融合表面受體：CTLA-4/CD28，FAS/OX40等也能夠顯著提升T細胞適應性。這些結果初步表明，通過人為敲入表達轉錄因子或表面融合受體，能夠有效提升T細胞在單次刺激下的適應性。

        為模擬長期刺激，作者將T細胞連續五次暴露于新鮮癌細胞，他們發現敲入轉錄因子（BATF和BATF3、TFAP4）和表面受體（白介素2型受體IL2RA和氨基酸轉運體）的T細胞在重復刺激后數量較多，適應性顯著高于對照T細胞。作者對這部分細胞進行了單細胞測序和半監督轉錄組聚類，其中有一簇CD8 T細胞高度表達增殖相關的基因，并且富集表達了多種在重復刺激下能夠提升T細胞適應性的轉錄因子如BATF3和TFAP4。非常有趣的是，TFAP4的敲入只影響T細胞對重復刺激的適應度。此外，作者還發現敲入TRAP4能夠顯著緩解T細胞的耗竭，升高T細胞內IL-2RA及IL2/STAT5信號通路水平，并且增加IFN-γ等效應細胞因子的產生。這部分結果表明，在T細胞中人為表達轉錄因子（如TFAP4）能夠顯著提升T細胞面對長期和強直刺激的適應度和免疫能力。

        盡管CD19-BBz CAR-T細胞（抗CD19的CAR-T）已經在臨床上獲得較好的治療效果，但作者同樣發現敲入表達BATF、BATF3、TFAP4或CTLA-4/CD28融合受體能夠增加CD19-BBz CAR-T細胞面對重復刺激的適應性，進一步強調了篩選T細胞基因工程化新方案的重要性。接著，作者發現同時敲入兩個轉錄因子組合能夠進一步提升T細胞功能。向“耗竭樣”的HA-GD2-28z CAR T細胞中同時敲入表達TFAP4和BATF（或BATF3），T細胞存活時間長于敲入單個轉錄因子的存活時間，并具有更強的殺傷能力，也更接近記憶T細胞的狀態。

        對敲入TFAP4和tNGFR（對照序列）的HA-GD2-28z CAR-T cells進行ChIP-seq和ATAC-seq，作者鑒定出了2232個TFAP4敲入調節的基因，他們發現TFAP4具有染色質重塑能力，與受調節基因的啟動子和基因近段增強子結合，促進了T細胞適應功能基因（IL2RA、IL12H和MYC等）的表達，抑制了T細胞功能障礙標記物（CD244，CXCR6和TIM-3等）的表達，表達升高的基因富集于翻譯起始和細胞分裂生物合成相關通路。通過分析同時敲入BATF與TFAP4的T細胞染色質開放情況，他們發現BATF和TFAP4之間存在協同促進作用，兩者能夠合作調控多個與T細胞激活相關基因的表達；BATF還可以打開TFAP4結合位點周圍的染色質區域，促進TFAP4與基因組的結合。總的來說，TFAP4是一種具有染色質重塑活性的轉錄因子，通過增強T細胞的增殖能力并抑制耗竭標記來平衡/優化T細胞行為，BATF通過兩種機制輔助TFAP4更好地與基因組結合，從而增強其對T細胞功能的改善。

        總的來說，該研究提供了一個向特定基因位點敲入片段并進行大規模文庫篩選的平臺—ModPoKI，并借此為我們揭示了BATF和TFAP4基因片段敲入能夠顯著改善T細胞功能，以及背后的分子機制，為開發腫瘤免疫療法的新型CAR-T提供了潛在的治療靶點。

        原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.08.013