T 細(xì)胞受體 (TCR) 基因療法是細(xì)胞免疫療法的一種有效形式，其中患者 T 細(xì)胞經(jīng)過基因工程改造，以表達(dá)具有明確腫瘤反應(yīng)性的 TCR。 然而，由于患者 T 細(xì)胞庫中腫瘤特異性 T 細(xì)胞普遍缺乏，以及腫瘤上表達(dá)的 T 細(xì)胞表位具有患者特異性，因此治療性 TCR 的分離變得復(fù)雜。近日，荷蘭癌癥研究所的Wouter Scheper等在Nature Biotechnology雜志發(fā)表了Discovery of tumor-reactive T cell receptors by massively parallel library synthesis and screening文章，報道了一種高通量、個性化的TCR鑒定技術(shù)，能夠在一個體系中中組裝合成TCR文庫，經(jīng)報告T細(xì)胞表達(dá)，通過患者來源的腫瘤細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞進行功能性篩選。通過此方法，從多個患者的腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocyte, TIL）中篩選出數(shù)千個TCR，并鑒定出數(shù)十個具有強腫瘤反應(yīng)性的CD4+和CD8+ T細(xì)胞來源的TCR，其中包括可識別患者特定新抗原的TCR。

        研究人員利用超高通量TCR基因合成將編碼各個TCR的CDR3Jα和CDR3Jβ序列的片段制備為單獨的單鏈DNA（ssDNA）寡核苷酸池。這些池中的每個寡核苷酸都包含獨特的正交雜交序列（Zip），其中Zip序列能夠以極高的保真度進行片段組裝，確保實現(xiàn)各個TCR的CDR3Jα和CDR3Jβ寡核苷酸的正確配對。此外，還包括大約20個核苷酸連接器序列（ConnA和ConnB），用于指導(dǎo)CDR3Jα和CDR3Jβ寡核苷酸分別與相關(guān)種系TRAV和TRBV等位基因配對。通過多步組裝過程，該方法可以產(chǎn)生了一個TCR亞文庫，其中每個分子都由與TCR特異性Zip序列耦合的TRBV、TRBC和TRAV結(jié)構(gòu)域（稱為"VCV"片段）組成。然后將TCR亞文庫到克隆到下游包含TRAC結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體中，形成完整的TCR文庫。NGS測序分析在概念驗證上證明這種新方法，一個反應(yīng)中可合成多達(dá)1,000個特異性的TCR。

TCR基因組裝流程（圖片來源：Nature Biotechnology）

        進一步為了確定該方法的可行性，對黑色素瘤患者NKIRTIL063的腫瘤CD8+TIL進行了單細(xì)胞TCR測序，并設(shè)計和合成了個性化的TCR文庫，該文庫編碼所有已鑒定的TCR (4542個測序的CD8+TIL中有928個TCR)。此外，文庫中還收錄了幾個針對常見TAA且具有不同親和力的HLA-A*02:01限制性TCRs作為內(nèi)對照，NKIRTIL063 TCR文庫被逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化到CD8+Jurkat細(xì)胞（圖2a）。 為了評估該篩選方法的靈敏性，這里首先利用所包含的對照TCRs，并評估了以MART1（EAAGIGILTV）特異性模型TCR DMF4和DMF5或WT1（RMFPNAPYL）特異性TCR C4和C4DLT的同源多肽脈沖的HLA-A*02:01陽性永生化B細(xì)胞系的篩選性能，通過流式細(xì)胞術(shù)（FACS）分離激活的T細(xì)胞或基于激活標(biāo)記表面表達(dá)的磁激活細(xì)胞分選（MACS），然后通過PCR擴增分離細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因TCR，并使用NGS進行定量。與MART1肽負(fù)載細(xì)胞孵育后，激活的T細(xì)胞中TCR DMF4和DMF5明顯富集，而WT1肽負(fù)載細(xì)胞的反應(yīng)則富集了TCR C4和C4DLT（圖2b）。值得注意的是，與低親和力的DMF4和C4 TCR相比，高親和力的DMF5和C4DLT TCR表現(xiàn)出更明顯的富集，表明T細(xì)胞-靶細(xì)胞相互作用的強度可以通過篩選數(shù)據(jù)來評估。

        接下來，為了評估篩選平臺對發(fā)現(xiàn)MHC II限制性TCR的適用性，合成了一個包含1341個TCR的文庫，該文庫編碼從卵巢腫瘤OVC190分離的CD4+TIL的單細(xì)胞測序確定的所有TCR，并在CD4+Jurkat細(xì)胞中表達(dá)該文庫。兩個以前從黑色素瘤患者的TIL中分離出來的MHC II限制性新抗原特異性TCR被納入該文庫作為內(nèi)對照。對用兩個對照TCR的任一同源多肽脈沖的患者匹配的永生化B細(xì)胞進行篩選表明，兩個新抗原特異性TCR對其同源新抗原的反應(yīng)具有明顯且唯一的富集。鑒于單個TCR的豐度在合成文庫中可能會有所不同，還評估了該篩選方法在抗原特異性TCR出現(xiàn)頻率低于平均水平的情況下的敏感性。為此，將表達(dá)NKIRTIL063文庫的Jurkat細(xì)胞與未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞混合，使得單個NKIRTIL063 TCR的平均出現(xiàn)頻率為1×10-3、0.3×10-3、1×10-4或0.3×10-4細(xì)胞總數(shù)。針對MART1肽負(fù)載的B細(xì)胞篩選，清楚地識別出兩種MART1特異性TCR，包括低親和力DMF4 TCR。因此該方法允許人們區(qū)分不同親和力的TCR，并篩選MHC I類限制性和MHC II類限制性TCR。

        為了評估該方法的TCR篩選方法對治療相關(guān)TCR進行個性化鑒定的可行性，接下來在NKIRTIL063庫中尋找腫瘤特異性TCR。先以抗原不可知的方式廣泛調(diào)查患者庫中的抗腫瘤譜系。因此，對與患者NKIRTIL063共享HLA-A*02:01的兩個同種異體黑色素瘤細(xì)胞系進行了TCR文庫的篩選, 成功篩選出針對細(xì)胞系RPMI7951和Malme3M的數(shù)十個富集的TCR，其中31個對Malme3M細(xì)胞的MHC I類依賴性識別。并進一步對另一名宮頸癌患者CV19的中TIL衍生的TCR的腫瘤反應(yīng)性進行了分析，針對患者6種MHC I修飾后的SiHa細(xì)胞篩選文庫，鑒定出34個有反應(yīng)的TCR。對表達(dá)HPV E7或E6細(xì)胞的篩選顯示，3個TCR對E7具有反應(yīng)性）。值得注意的是，用SiHa反應(yīng)性而非HPV E7反應(yīng)性TCR改造的T細(xì)胞能夠識別患者的自體腫瘤消化物(圖4 g)。

       研究人員鑒定了黑色素瘤患者NKIRTIL063的非同義腫瘤突變，并設(shè)計和表達(dá)了串聯(lián)小基因(TMG)構(gòu)建體，將所得20個表達(dá)TMG的B細(xì)胞系合并為5個庫，用于篩選患者TCR文庫。共篩選出32個富集的TCR，并證實了32個TCR中的22個（69％）針對TMG3、7、8和16具有反應(yīng)性。TMG解析后并最終確定了四種新抗原（GFPT2 A676V、CCSER P329L、TNFAIP2 P348A和ADAM10 P164L）作為篩選識別的TCR的同源靶標(biāo)。為了評估了在腫瘤特異性TIL的頻率較低的冷腫瘤中鑒定針對新抗原特異性TCR，從而還研究了卵巢癌患者OVC190。在卵巢癌患者OVC190中找到了3種的新抗原反應(yīng)性TCR，這些TCR均識別MTREX D398A新抗原。TCR工程化改造后的CD4+T細(xì)胞對表達(dá)MTREX D398A的B細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性，但對表達(dá)野生型MTREX序列的細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。在該患者腫瘤中CD8+TIL來源的TCR中未發(fā)現(xiàn)新抗原特異性TCR。

       綜上所述，腫瘤抗原特異性TCR篩選技術(shù)可用于發(fā)現(xiàn)個性化腫瘤特異性和新抗原特異性TCR，并應(yīng)用于治療腫瘤特異性TIL通常很少見的癌癥患者。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-024-02210-6

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6×NFAT啟動子Jurkat細(xì)胞系
IL-2啟動子Jurkat細(xì)胞系